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TEV酶的酶切位点
TEV酶，作为一款常用于切除融合蛋白上亲和标签的高效工具，其独特的酶切特性在于其对特定七氨基酸序列的识别：EXXYXQ↓（G/S），这个切割点位于谷氨酰胺与甘氨酸/丝氨酸之间。其中，ENLYFQG是最常见的氨基酸序列，而ENLYFQS则被认为是效率最高的切割序列。
在进行酶切操作前，质粒的电泳图通常会显示出三条带，它们从上到下依次为线性、开环和超螺旋状态，不过实际情况可能会比这三条带复杂，因为还可能存在中间复合体状态。酶切后，由于超螺旋质粒被切割成线性，因此电泳图上只会显示一条条带。
TEV protease（TEV蛋白酶）酶切位点：Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly/Ser。特点：最佳酶切温度为30℃，在4℃时也保留了一定的活性。应用：常用于需要保留目标蛋白活性的酶切过程。Thrombin（凝血酶）酶切位点：来源于牛血浆，酶切位点不特定，但常用于抗体切割。
可能原因蛋白酶活性不足：使用的蛋白酶（如TEV、凝血酶、Factor Xa）活性受缓冲条件（pH、离子强度、温度）影响，金属离子依赖性蛋白酶（如TEV需要Zn）缺乏必要辅因子。
在裂解液中添加蛋白酶抑制剂 cocktail（如PMSF、EDTA）。针对额外酶切位点：修改目的蛋白序列，突变非目标酶切位点（需确保不改变蛋白功能）。选择特异性更高的蛋白酶（如TEV蛋白酶替代凝血酶）。分步酶切：先用一种酶切割，纯化后再用第二种酶处理，减少同时切割多个位点的风险。